单纯疱疹病毒(HSV) 1+2 IgG/IgM/IgA [复制链接]

11.参考文献

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　赛润 ELISA classic 单纯疱疹病毒(HSV) IgG/IgM/IgA

酶联免疫法测定人体抗体IgG/IgM/IgA

- 只限用于体外诊断-

HSV 1+2 IgG 试剂盒 (定量)       编号:  ESR105G

HSV 1+2 IgM 试剂盒 (定性)       编号:  ESR105M

HSV 1+2 IgA 试剂盒 (定量)      编号:  ESR105A

HSV 1 IgG 试剂盒 (定量)         编号:  ESR1051G

HSV 1 IgM 试剂盒 (定性)         编号:  ESR1051M

HSV 2 IgG 试剂盒 (定量)         编号:  ESR1052G

HSV 2 IgM 试剂盒 (定性)         编号:  ESR1052M

检测评估标准: Dade Behring BEP ® III / BEP ® 2000, DSX, 手动操作

1.     用途

赛润ELISA classic 单纯疱疹病毒I型IgG/IgM 和II型IgG/IgM或I/II IgG/IgA复合型试剂主要用于定性和/或定量检测人血清或血浆中产生的对抗单纯疱疹病毒I型IgG/IgM 和II型IgG/IgM或I/II IgG/IgA复合型的抗体。试剂可用于急性感染疾病中的鉴别诊断和确认血清转化的病人是否是初期感染，此外还可用于诊断机体免疫状况和围产期诊断。

2.     诊断意义

单纯疱疹病毒I型和II型（HSV 1/2）是疱疹病毒属的一种,它是致病性DNA病毒。

疱疹病毒已在全球范围内传播。在工业化国家10-20岁的人群中疱疹病毒感染的血清检出率高达50%，甚至在90%成年人体内发现了单纯疱疹病毒的血清变型1，10-15%有单纯疱疹病毒的血清变型2。

初期感染后，病毒会以一种特定的天花板格形（潜伏期）持续存在直至再激活（冬眠期）。病毒的再激活对免疫力正常的人来说没有明显的临床症状，而对免疫能力低下的人则会出现严重的临床并发症。

潜伏期在2-12天之间，传染性会持续至皮肤或粘膜出现疱疹(约3周时间)或内源性感染复发期。I型单纯疱疹病毒的初期感染90%没有明显的症状，有10%左右的病人会在唇、口或眼角膜及结膜部位出现特征性的疱疹。

这些脓疱性疱疹会在有湿疹的皮肤上扩散，并可能会危及生命。进一步的并发症是大脑炎 (70 % 是致命性的)或脑膜炎。12 % 的II型单纯疱疹病毒初期感染会出现突然性流产、外阴阴道炎或阴茎阴囊皮疹。

尽管多数生殖器的疱疹病毒感染是由II型单纯疱疹病毒引起的，但I型单纯疱疹病毒引起的感染也有20%。感染初期的症状是相同的，但生殖器感染I型单纯疱

疹病毒后的再激活机率明显比II型低。II型单纯疱疹病毒对生殖器感染是I型的4倍，流行更广且具有显著的临床症状，而I型单纯疱疹病毒生殖器感染的临床复发率通常是很低的。II型单纯疱疹病毒生殖器感染可用抑制病毒复制的抗病毒药物治疗如阿昔洛韦、缬昔洛韦和泛昔洛韦，单纯疱疹病毒I型和II型的血清学及病毒学差异能够指导对疾病的正确预后和治疗。

3. 赛润ELISA classic - 检验原理

用抗原包被微量板孔，制成固相载体。加患者血清到板孔中，其所含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原结合，形成免疫复合物。除去多余物质后，加入碱性磷酸酶标记的IgG、IgA和IgM抗体，使之与上述免疫复合物反应。洗板，除去多余的结合物，加入底物（对硝基苯磷酸盐）。该反应产生有颜色产物，颜色强度与特异性抗体含量成正比。

4.试剂盒的组成

5.其它检测所需物质

- 普通实验室所需的仪器装置

- IgM检测：特别赛润对照抗原类风湿因子Rf－吸附剂（Rf－吸附剂／对照抗原；产品编号T200/20ml）

- 分光光度计，波长405纳米，建议参考波长范围620纳米- 690纳米（例如 650纳米）

- 37℃温箱

- 湿盒

- 蒸馏水。

6.储存及稳定性

7.赛润 ELISA classic的检验步骤

7.1注意事项

只有全部使用赛润 ELISA classic试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其他制造商的产品。尤其是标准血清，对照血清以及酶标记物，必须使用试剂盒配备的，不要使用其它批号产品。稀释缓冲液，洗液，终止液和底物溶液可用于所有赛润 ELISA classic试剂盒。

未开封的情况下，如果保存于2-8℃，ELISA classic试剂盒内所有试剂均在标定的有效期内有效。详细的稳定性和储存资料在“6. 储存及稳定性”内将加以详述。

每一种试剂都是经过校准以保证最佳的检测结果。这些试剂如果经过稀释或改动都会导致检测的敏感度的降低。

在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。

如果铝袋破损或者已开启装有干燥剂的铝袋而未以夹子封紧的，则不要继续使用微孔条。

开始试验前，将所有试剂置于室温。

从试剂管中吸取试剂的时候，应注意使用无菌技术以防污染。为避免假阳性结果，吸加酶结合物时，吸嘴应确保不接触或喷洒于小孔的顶避，注意不要盖错瓶盖或管盖。

试验结果的可重复性依赖于充分混合试剂。使用前振荡装有对照血清的小管和所有稀释过的溶液（例如使用混合器）。

小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 对照血清，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。

只有严格遵守赛润ELISA classic试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。

如果实验中未严格遵守质量控制认证文件上的有效性特异准则，则试验结果无效。

洗涤不充分将影响试验结果：

应该小心进行洗涤。洗涤步骤应遵守相关洗涤器（平底孔，孔直径7毫米，深10.9毫米）指导手册进行，所有的孔内均应加入相同体积的洗涤缓冲液。洗涤结束时，应将微孔板倒扣于纸巾上并轻轻敲打，以确保所有孔内均无洗涤缓冲液。避免产生泡沫！如果使用自动洗板机，注意正确操作。

7.2检验前的准备工作和储存

为避免干扰结果，高血脂的，溶血的，或污染的血清不要用于检测。

样品不应加热灭活。

7.2.1样品准备

赛润 ELISA classic 单纯疱疹病毒 IgG/IgA

开始试验前，患者的待测样品必须以稀释缓冲液稀释如下（V1+V2）：

稀释后及加入微孔板前，样品必须充分混合。

赛润 ELISA classic 单纯疱疹病毒 IgM

类风湿因子抗体是IgM的自体抗体，可与IgM免疫复合物结合。非特异性IgM抗体（类风湿因子）的存在将导致IgM检测的假阳性结果。另外，也存在弱结合的病原体特异性IgM抗体被强结合的IgG抗体取代的可能性。在这种情况下，IgM的检测将得到假阴性的结果。因此，在进行IgM检测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预处理。

特别类风湿因子Rf—吸附剂（产品编号T200,20ml）不仅包含抗人IgG抗体，还含有一定量的对照抗原。类风湿因子和抗体可识别宿主细胞的膜成份，并与之结合。不必进行微量孔内覆有对照抗原的平行试验。

在进行以下SERION ELISA classic IgM检测时，此类RF—吸附剂需作为附加试剂另行购买：

巨细胞，单纯疱疹病毒，麻疹，腮腺炎，风疹病毒，刚地弓形虫，带状疱疹病毒

首先应该使用稀释缓冲液(V2)对类风湿因子吸附剂(Rf-吸附剂/对照抗原)(V1)进行如下稀释：

然后将患者的待测样品(V1)在此Rf-稀释缓冲液(V3)中进行稀释：

7.2.2样品储存

密封的患者样品可在冰箱中2-8℃保存7天。≤ -20℃可保存更久。

避免样品反复冻融。

已稀释的样品可在2-8 ℃保存一星期。

7.3 试剂盒反应试剂的准备工作

7.3.1  微孔条

微孔条置于一框架内，并与干燥剂一同封于铝袋之中。应将不需要的微孔条取下并重新放入铝袋。将袋口折叠2-3次，并以夹子夹紧，确保铝袋的密封性。

7.3.2  对照血清 / 标准血清

对照和标准血清立即可用，不必进一步稀释。试验时，可直接使用。

对于每次试验和每批检测体系，无论使用的微量板数目的多少，均应包括阴性阳性对照孔。界定对照应作双份。如果是定量试验，标准血清也应作双份。

不要用RF吸附剂处理对照血清！

7.3.3  抗人 IgG, IgA 或IgM抗体稀释液，用 AP标记（即用）

禁止将不同试剂盒的酶标抗体混合。同一试剂盒才能具最佳检测效果。

7.3.4  洗液

以1：30稀释浓缩洗涤缓冲液（V1）至终体积V2。

例如：

7.3.5  样品的稀释缓冲液（即用）

7.3.6  底物（即用）

试验时戴手套以避免污染。必须以无菌针头吸取底物溶液。

7.3.7  终止液（即用）

7.4   检测程序概要

单纯疱疹病毒(HSV)

IgG/IgM/IgA定量

进行IgM检测时先吸除RF因子，见7.2.1

                      室温孵育15分钟或4℃过夜

样品稀释液（病人血清）

1+100

¯

将稀释的样本，和立即可用的对照血清 / 标准血清，加

到微量孔内（100微升）

¯

¯

洗涤

¯

  加入已稀释的酶标记抗体溶液（100微升）

¯

¯

洗涤

¯

   加入底物溶液（100微升）

¯

¯

加入终止液（100微升）

¯

7.5检测过程

7.5.1  将检测所需数目的微孔条放到微孔板框上并准备好一张草签。

7.5.2 在微量孔内分别加入100微升的已稀释样本或立即可用的对照血清。留一个孔为底物空白使用，例如：

7.5.3  将样品于湿盒内37℃（±1℃）孵育60分钟（±5分钟)。

7.5.4  孵育后以洗液缓冲液洗涤板孔（使用自动洗板机或手工洗板）：

- 吸去或甩去洗液

- 每孔内加入300微升洗液

- 吸去或甩去洗液

- 重付息涤过程3次（共4次！）

- 将微孔板翻转过来在纸巾上拍打，使微孔中不再含有液体

7.5.5  加入酶标记抗体。

于适当孔内（底物空白除外）加入100微升 IgG / IgM / IgA酶标记抗体

7.5.6  湿盒内37℃（±1℃）孵育30分钟（±1分钟）*。

7.5.7 孵育后，以洗液清洗板孔（洗涤见上）

7.5.8  加入底物

于每孔内加入100微升底物溶液（包括底物空白孔）

7.5.9  湿盒内37℃（±1℃）孵育30分钟（±1分钟）*。

7.5.10 终止反应

7.5.11 读取消光度

以底物空白为空白对照液， 60分钟内读取405纳米的OD值，建议参考波长范围为620纳米-690纳米（例如650纳米）。

8．检测结果评估：

   赛润 ELISA classic 单纯疱疹病毒lgG/IgM/IgA（定量）

8.1 4PL单点定量法

通过利用非线性方程，可以保证根据消光信号的定量数值精确计算出抗体活性，该方程可在不对OD值进行转换的情况下调整S型曲线。

用赛润 ELISA classic试剂检测，抗体浓度可通过逻辑对数模型（4PL, 4个参数）来计算，该模型对浓度曲线有很精确的适用性。计算公式如下：

参数A、B、C和 D能够反映曲线的精确形状。

1. 下端渐进线          [ 参数A

2. 曲线斜率            [ 参数B

3. 转折点              [ 参数C

4. 上端渐进线          [ 参数D

标准曲线是由德国维润赛润研发有限公司（维尔茨堡市）在严格条件下经过多次试验制定的。使用者无需花费大量的时间和使用昂贵的仪器来制作标准曲线。

每一个试剂盒内均附有专用的标准曲线和评估表用来计算抗体浓度。如有需要也可取得相关的评估软件。

为了校正正常试验偏差和建立试验对照，每轮试验均需使用标准血清作为对照。该对照血清的有效范围参考值是由厂商的质量控制部门确定的，在此范围内可保证抗体浓度测定的正确性。标准血清不一定是阳性对照，且在某些ELISA试验中标准血清数值可能是临界值或阴性结果。

8.2 有效性标准

-     底物空白的OD值必须 < 0.25

-     阴性对照必须为负值

-     ELISA定量试验：标准血清的平均OD值必须在有效范围内，此范围已在试剂盒专用的质量控制证书中给定（减去底物空白之后！）

-     ELISA 定性试验：阳性对照的平均OD值必须在有效范围内，此范围已在试剂盒专用的质量控制证书中给定（减去底物空白之后！）

如果未达到以上标准，则试验无效且必须重做。

8.3 赛润 ELISA classic单纯疱疹病毒1、2、1+2 IgM（抗原/对照抗原）的定量计算

8.3.1 非自动评估

每个试剂盒内均备有一个标准曲线和一个评估表，因而每一个OD值都可得到一个抗体活性值。标准血清的参考值和有效范围已在评估表格（质量控制证书）中给定。

所有的OD值在求值前必须先减去空白（A1）。