单纯疱疹病毒HSV实验室诊断 HSV概述 单纯疱疹病毒HSV是人类最常见的病原体，人是其唯一的自然宿主。HSV主要有两个血清型：HSV-1和HSV-2。HSV-1主要侵犯躯体腰以上部位，HSV-2侵及躯体腰以下部位，主要是生殖器，它是引起性病的主要病原体之一。健康人通过与患者直接密切接触和性接触而被感染。妊娠期胎儿可能通过胎盘传染，分娩时经产道感染。病毒感染后以隐性感染为常见，仅有10％-20％的初次感染者出现症状[25]。 HSV隐性感染的特点，是其得以广泛传播的重要原因之一。又由于HSV2常与其它病原体如：梅毒、念珠菌、疥疮等引起的疾病有相同的临床症状，而先天性单纯疱疹病毒感染与先天性弓形虫、风疹、巨细胞病毒感染的临床表现都很类似。所以，单纯疱疹病毒的确定性诊断对于疾病的控制和管理；选择适合的治疗方案以及说服病人配合方面都是非常重要的[1]。临床诊断应该通过实验室检测进行确定。 HSV感染与HIV一样为终生携带。培养或抗原检测仅适用于有明显症状的急性感染或急性发作。然而，大多数HSV感染为隐性或症状不明显， 抗原检测对此则无能为力。血清学特异性IgG抗体检测不仅能用于隐性感染的检测， 还能简便而准确地区分HSV-1和HSV-2[2,3]。 英国某研究指明：97%患者认为血清学检测HSV是有用的，它们表示愿意接受HSV1及HSV2血清抗体检测。我国性病门诊患者也认可该项检测，认为其对确定病因、判断是否存在生殖器疱疹很有价值[4]。 目前实验室使用的抗体检测通常为非特异性的，容易与其它疱疹发生交叉感染，导致低灵敏度和低特异性，造成漏诊和误诊。国内专科医生已经注意到这种情况，他们迫切需要一种高特异性HSV检测试剂。 HSV流行病学 人群中HSV感染普遍，发展中国家成人抗HSV抗体阳性率为95-100％，其中原发性感染中80－90％为隐性感染。新生儿HSV感染发病率为0.05-1/1万，其中绝大多数为母亲生殖道HSV上行播散或分娩时经产道感染所致。 由于对HSV无免疫，故成人感染增加。HSV-2是生殖器疱疹的主要病原体，90%生殖器疱疹病例是由HSV-2型引起，10%由HSV-1型引起【7】。生殖器疱疹已成为欧美最常见的性病之一。现在全球的感染率超过1亿【5】。如英国自1971年的4000例增至19８5年的20000例。美国大于19岁的青少年中，有1/5的人感染HSV，自1970年以来HSV2感染上升了30％，12－19岁青少年HSV2感染率增加了5倍，20－29岁成人HSV2感染则增加了2倍。估计美国现累计病例超过4500万。在发展中国家，HSV-2血清流行率更高，如乌干达妇女保健诊所高达41%，秘鲁STD中心为83%【6】。估计目前我国HSV感染的确切流行情况是困难的，但可以肯定的是我国近几年生殖器疱疹也明显增加。1991年我国16个大中城市性病检测仅报告156例HSV感染，而2001年广东省就报告了HSV 5499例，占性病中的5.86%[25,26]。 HSV传播途径
1、HSV1主要通过密切接触传播，通常与嘴唇和脸相关。儿童容易感染。90％的成人对HSV1有抗体。 2、HSV2主要通过性接触传播。据调查，HSV2抗体通常在青春期有了性行为之后才出现，这种抗体似乎与以前有性行为有关。80%的妓女有这种抗体，而修女有这种抗体的只占3%。生殖器疱疹患者及HSV携带者具有很高的传染性，与之发生性关系后，50~80%会被感染。一般20-30%的成人有抗HSV2抗体。 1型和2型HSV也可能发生交叉感染。
3、新生儿感染：其传播途径主要有宫内、产道以及产后接触感染,其中产道感染占75％。新生儿感染中80％由HSV-2引起，20％由HSV-1引起。 HSV所致疾病【7，8，9，27】 1. 原发感染
原发性HSV感染的症状最重，可伴有全身症状如发热、头痛、不适和肌痛。局部症状则有尿痛、白带、阴部疼痛、腹股沟淋巴结肿大，外阴、会阴、腰部、臀部、阴道疱疹等。但子宫颈疱疹症状较少，常易被忽视。另外也u有不少病人，原发感染症状极其轻微，甚至毫无症状，亦被忽视。 HSV侵入粘膜或破损的皮肤，约经1~26天（平均5~7天）的潜伏期，便在入侵部位产生红斑，丘疹及水疱性损害。早期损害通常是一群或数群红色刺激性或疼痛性斑丘疹，直径3~5毫米，约24~36小时之后会发展成小水疱，疱液清晰，5~6天后，成群的小水疱顶端露以灰色痂，疱液变黄，继之水疱破溃，形成小灶性疼痛性浅表溃疡。溃疡灶底部呈浅黄色，周围可有红晕。有时小灶性溃疡可融合成片，形成大面积溃疡给诊断带来困难。虽然原发性生殖器疱疹会反复发作，但若无并发症，几乎所有的皮肤粘膜损害都会在2~3周内消退。痊愈后3周找不到病毒。85％的患者在21天内产生病毒抗体。 体征：皮损为红斑基础上可见成群的水疱或脓疱或成糜烂及溃疡。女性患者约90%伴有HSV宫颈炎，宫颈可见发红、糜烂、溃疡，有脓性阴道分泌物。有的患者可有腹股沟淋巴结肿大压痛或体温升高。皮肤病变也可出现在口唇 、手指、臀部、大腿、手臂，甚至眼部与咽喉。并发脑膜炎或横贯性脊髓炎，一般于发疹后3-12天出现颈项强直等颅内压增高的现象。 2．隐性感染和复发 HSV原发感染产生免疫力后，将大部分病毒清除，部分病毒可沿神经髓鞘到达三叉神经节（HSV—1）和脊神经节（HSV—2）细胞中或周围星形神经胶质细胞内，以潜伏状态长期持续存在，与机体处于相对平衡，不引起临床症状。此时不可检测出病毒。不同亚型HSV感染者急性首发生殖器疱疹的临床过程相似，但生殖器病变复发率不同，首发生殖器疱疹HSV-2感染者约90%，在12个月内会出现一次复发（平均复发4次），而初次感染HSV-1者仅50%出现类似复发（平均复发次数小于1）。不同个体及同一病人一生中生殖器HSV-2感染的复发率变化很大，大多数年复发5-9次，一般在原发疱疹消退后1-6个月内发生，有些患者受到促发因素，如发热、月经、日晒、寒冷、某些病毒感染等的影响而复发，其特点是每次复发往往发生在同一部位，复发前可有前驱症状如局部瘙痒，发疹前数小时感染部位有灼烧，麻刺感。 3．孕妇HSV感染
孕妇由于孕期激素增加，抑制细胞介导免疫，而易于妊娠期内感染HSV，感染发生率约0.4%～1%，较非孕妇高2～3倍，并且既往感染者发生复发疱疹的机会大大增加。母亲患原发疱疹时40~60%的新生儿会被传染，复发疱疹时则少于8％。原发疱疹有大量病毒，且宫颈炎发生率高。而复发疱疹母亲的HSV抗体传给胎儿，防止或减少了胎儿的宫内感染，胎儿宫内受染可发生流产或死胎；但胎儿经复发疱疹的产道娩出仍可受感染，危险性在40%～60%。 4．先天性及新生儿感染 先天性感染可经胎盘传播或经生殖道上行性感染引起胎儿宫内感染，诱发流产、早产、畸形、死胎等,且发生的畸形与胚胎早期的弓形体、巨细胞病毒、风疹病毒感染造成的畸形相似，如小头、脑钙化、血小板减少、小眼球、脉络膜视网膜炎等，也可以发生皮肤疱疹、心脏及肢异常等。 新生儿经过受感染的产道娩出或直接接触疱疹病人可受感染，危险性在40%～60%，其中60%～70%致死，幸存者而无后遗症的只有15%。一般有以下几种感染类型： A.全身播散型感染：有1/3病儿有疱疹性皮肤、口腔或眼病损。全身播散型感染使多脏器受损害，可发生肝炎出现肝功能异常、肝脾肿大、黄疸；发生肺炎、出现呼吸困难、紫绀、多数可导致弥散性血管内凝血、出现血尿、血梗、血小板减少性紫癜、发生全身中毒、出现吸乳差、呕吐、腹泻、精神萎糜、惊厥、昏迷、还可发生心包炎、脑炎而致循环衰竭。该型感染预后不佳，死亡率达80%。 B．局限性感染：约占20－40％，其中50－90％可见疱疹。疱疹出现在口腔、咽部、眼、皮肤。可融合成大水泡、脓疱并剥落，损害可因分娩方位不同在头、肛周围、臀，或在产前引起的损伤部位，损害可限于局部，也可广泛皮肤受累，有些病儿常可继续发展成播散型或中枢神经系统感染。 C．中枢神经系统感染：约30－50％。以中枢神经系统为主要表现，多无典型的皮肤粘膜疱疹。多为HSV2所致，可发生于扩散性感染，亦可单独出现。发生脑膜炎而颅内压增高，出现抽搐、病理反射、昏迷、视神经乳头水肿、脑脊液中白细胞增多，蛋白含量增加，伴发皮肤，粘膜疱疹、病死率约为30%，如不及时治疗，病死率为40－50％；存活者多数留有小头畸形、脑积水、神经运动障碍等后遗症。 D．呼吸系统感染：表现为出生后3－14天，出现不同程度的呼吸窘迫，呈进行性加重。亦可表现为疱疹病毒性肺炎。典型患儿常见血小板减少、凝血障碍、循环衰竭，多数死亡。 5．HSV与瘤癌的关系 在人类，病毒感染与瘤癌之间可能有连带关系。许多病毒在不同动物中有致癌的作用。已有大量关于HSV2抗体的妇女与宫颈癌之间有密切联系的报道。妇女感染HSV2后，其宫颈癌发病率增加；宫颈癌患者的HSV抗体阳性也高。这些可说明HSV2感染与宫颈癌之间有密切关系，但尚不能肯定其间的直接关系。 6．HSV与HIV HSV常与HIV-1同时感染，并能促进病情发展，引起严重的局部和播散性感染。目前认为HSV是一种调节因素，能激活HIV复制，Heng对6例AIDS合并生殖系统HSV皮肤损害患者进行皮肤活检，发现角化细胞和巨噬细胞均有HIV-1和HSV-1杂交后使HIV-1保留其感染性，而无需与CD4分子结合即能进入细胞内。此外HSV-1能刺激潜伏型HIV-1，而增加HIV-1/HSV-1共同感染和在组织中的复制。 HSV免疫学 HSV感染早期可以检测到HSV特异性IgM抗体，IgM持续8周，但在潜伏感染及无症状感染者中检测不到IgM,而且HSV IgM抗体出现不规则，故血清IgM抗体不是复发或无症状再激活的可靠判断指标，但其常提示为原发感染。如新生儿病毒分离阳性或血清抗HSV IgM阳性则可确诊。 原发感染时，在症状出现4天可检测到HSV IgG抗体，但一般在感染后2个星期，HSVIgG抗体才出现高滴度，此后随着HSV潜伏在体内，HSV IgG可终生携带，所以，HSV IgG对于隐性感染病人检测有很重要的意义。一般情况下，无症状感染者和将复发疱疹者的HSV IgG抗体滴度无差异，但病毒再激活时IgG抗体升高【7】。 因此，HSV IgM检测适用于新生儿疱疹诊断和原发感染；而IgG适用于过去和复发感染，以及隐性感染病人检测[28]。 HSV的预防与治疗[25] 预防 l 对有症状的病人避免性接触。 l 目前尚无特异性的疱疹疫苗。 l 应对病人进行精神安慰，但说明有复发的可能；在出现复发前驱症状时口服抗病毒药物，可产生部分或完全的保护作用。 l 少数复发性生殖器疱疹需做复课检查，除外早期宫颈癌。 l 早期妊娠患原发生殖器疱疹，胎儿有被感染的可能，但不是终止妊娠的绝对指征；确定诊断后，可根据孕妇的意思作出是否终止妊娠的决定。妊娠末期感染HSV者应该做剖腹产。 l 依照美国传染病学会建议，对妊娠反复发作的HSV处理如下： 分娩时如确认无活动性生殖器损害，无需剖腹产。 妊娠未满3个月，症状性复发是短暂的，只要分娩时无活动性损害，可以经阴道分娩。 l 临产时有活动HSV者，可做如下处理：A.羊膜未破，孕妇不发热，胎儿尚未成熟，应延缓分娩；B.如足月妊娠，羊水已破，胎儿已成熟，应该进行剖腹产。 治疗 一般治疗：局部治疗以减轻患者的痛苦及局部并发症。 抗病毒治疗：主要为阿昔络韦（ACV,无环鸟苷） HSV实验室诊断【6－12】 ![]()
复发HSV感染 ![]()
HSV实验室诊断方法 几种HSV实验室检测方法之比较 比较项目/ 检测方法 | 培养分离 | 抗原 | PCR | 血清学抗体检测 | DFA/IFA | ELISA | ELISA | WB | 适用对象 | 原发感染 有症状病人，有明显 疱疹出现 | 原发感染 有症状病人，有明显 疱疹出现 | 疑为脑炎或先天性疱疹病毒感染患者、有神经系统并发症 | 培养或其它方法阴性确认 隐性病人(IgG) 伴侣确诊为HSV感染者筛查 孕妇筛查 | 灵敏度 | 较低 | 较高 | 高 | 非常高 | 高 | 非常高 | 特异性 | 较高 | 一般 | 较高 | 高 | 高 | 非常高 | 标本要求 | 最高 泡液或溃疡期分泌物 | 一般 疱疹基部分泌物 | 一般 泡液或溃疡期分泌物 | 较低 脑脊液 羊水及婴儿血清 脑组织 患处分泌物 | 低 血清 | 低 血清 | 试验时间 | 5－10天 | 30分钟 | 1－3小时 | 30分钟 | 1－2小时 | 1－2小时 | 操作难易 | 非常难 | 简单 | 简单 | 难 | 简单 | 难 | 成本 | 高 | 一般 | 较低 | 非常高 | 较低 | 高 |
（一） 病毒分离 由于需要疱疹泡液患处分泌物作为标本，所以，病毒分离培养方法只在疱疹期(1－2周)适用此方法。且随着疱疹的发展，若发疹时病毒分离率为97％，则脓泡期降为87％，到溃疡期则有70％，结痂时病毒的分离率只有27％。所以疱疹后期容易出现假阴性结果。 从水疱底部取材接种易感细胞中培养1～2天，出现细胞肿胀，变圆，相互融合等病变，可作初步诊断。然后用免疫荧光法（IFA），酶联免疫吸附试验（ELISA）进行鉴定，确诊HSV。必要时进行分型。 整个过程需5-10天，而且技术条件要求高，价格昂贵，不能普遍使用。 （二） 抗原检测 与病毒分离一样，由于抗原检测需要的也是水疱标本，所以也只能在疱疹期适用。常用的抗原检测方法有DFA、IFA、ELISA等。 ELISA使用泡液或患处分泌物标本，检测前需要进行处理。且整个ELISA试验过程需要2小时以上。ELISA适用于大批量标本的检测，如标本量较少，则成本相应增加。 DFA法可以直接使用患处基部分泌物标本，检测前不需要特殊处理。使用该法一般30分钟内可以得出检测结果，所以尤其适用于标本量较少的实验室和医疗机构。而研究表明DFA与病毒分离培养方法结合，其灵敏度可以提高10-15％。所以两者的灵敏度相当。 现在市场上抗原检测MicroTrak HSV直接标本DFA, 其与培养法相比灵敏度和特异性为90％和88％。ELISA检测试剂有IDEIA HSV，其灵敏度与特异性分别为93.6%和90%。 上述两种方法准确性是比较可靠的，但仍然存在以下问题： l 伤口治愈或消失后检测不到病毒感染，可以使用的期间较短，即只有在疱疹前期才可以进行抗原检测，伤口溃疡后期或愈合后，抗原检测方法容易造成假阴性结果。 l HSV在实验室的培养很少成功，或者用于抗原检测的标本量不足。 l 从另一方面来说，由于HSV2引起的疱疹典型，大多数情况下不需要实验室诊断即可确认。 所以国外进行HSV2检测使用抗原检测法较少。 （三） DNA检测 HSV的中枢神经系统感染单独出现时诊断比较困难。一般对脑组织进行病毒分离或检测特异性抗原、脑脊液分离病毒或检测特异性抗原虽可确诊，但阳性率太低，可能是由于病毒量太少。现报告PCR可以进一步提到灵敏度，是以后诊断HSV中枢神经系统感染的趋势。 毫无疑问，PCR是最敏感的一种检测方法。但也是由于其高灵敏度，容易造成假阳性结果。从实验要求来看，PCR成本、技术、实验室要求等都很高。我国现已对PCR实验室实行规范化管理，要建立一个规范的PCR实验室对于大多数医疗机构和实验室来说在现阶段来说是不可能的。而在国外，PCR也只限于在一些条件较好的实验室使用。 另外隐性感染或带毒期病毒隐藏在神经节时，PCR检测对于一般的标本也无能为力。 （四） 血清学检测[20-24] 血清学检测疱疹病毒感染是一种非常吸引的方法。 l 对培养法阴性标本进行确认 l 诊断隐性病人 l 性伴侣为疱疹感染的人群筛查 l 孕妇和新生儿筛查 用血清学诊断单纯疱疹病毒感染是非常快的，因为一旦一个人被感染，其体内免疫物质出现免疫应答，进而出现抗体。单纯疱疹抗体在首次感染4天即可出现，IgG抗体则在2个星期后出现高滴度。IgM则更早出现。 血清学检测方法有韦斯顿印迹法（WB）、补体结合试验方法，ELISA方法。 HSV型特异性IgG抗体ELISA检测 由于HSV1与HSV2在症状和治疗上有很大的不同，其分型就显得尤为重要： l HSV是终生感染 l HSV在60－85％成人体内普遍存在[13] l 生殖道HSV-2比HSV-1病变更严重，生殖道疱疹是一种很难控制的性病病毒,HSV1和HSV2诊断分型后可对症治疗 l HSV2常是隐性的，90％的带菌者没有症状, 许多性病患者并没有意识到HSV2感染[14,15] l HSV患者感染HIV的可能性为正常人的两倍[16] 虽然HSV1和HSV2具有50％的同源序列，两者非常容易发生交叉反应。但由于其特异性糖蛋白G(Gg)抗原的不同，通过其血清学特异性IgG抗体ELISA或WB检测方法可以实现HSV-1和HSV-2的准确分型。 抗HSV IgG抗体是HSV感染的重要标记，用于检测HSV的型特异性免疫学方法其试剂的不同之处主要在于其使用的免疫抗原的不同，高度特异性的HSV型特异性检测试剂应该是基于糖蛋白G(gG)特异性的。美国CDC指出限制使用非特异性的HSVIgG检测试剂[12]。 目前市场上检测HSV2和HSV1特异性抗体的试剂很多，但通常为非特异性的，容易与HSV1或其它抗体发生交叉反应。有的在检测只含有HSV1的标本中显示HSV2阳性；有的在HSV1存在的情况下，不可以检测出HSV-2。要想对HSV做准确的诊断，选用最好的实验方法显然是必须的。 Ashley et al[16]的研究比较了3种HSV检测试剂盒，发现其准确率低于一半。而Martins et al[17]的研究则以WB为金标准，用了另外3种试剂进行对比，发现在低感染率人群，能够准确进行特异性分型的比率难以让人接受。Martins的研究结果如下： 3种酶联免疫法检测HSV抗体IgG之比较 公司 | 交叉反应 | 灵敏度 | 特异性 | HSV1(%) | HSV2(%) | HSV1(%) | HSV2(%) | Diamedix Zenus Wampole | 82% 54% 47% | 100 92 98 | 100 98 95 | 77 72 68 | 61 79 85 |
摘自美国临床病理学杂志 幸而具有高灵敏度和高特异性的检测HSV2型特异性的ELISA检测实际也已经问世。以下试剂是通过美国FDA认证或认证过程中的，其准确性可以与HSV抗体检测的金标准WB相当 FDA认证HSV2型特异性检测试剂盒 公司 | 实验 | FDA认证 | Trinity | Capita Typing Specific HSV-2&HSV-1 EIA | FDA认证过程中 | Focus | HerpeSelect HSV-1 IgG ELISA HerpeSelect HSV-2 IgG ELISA | 通过FDA认证 |
用Trinity Capita Typing Specific HSV-2 与 Focus的HerpeSelect HSV-2 IgG进行比较，结果如下：（研究使用2种试剂对163份未知标本进行检测，排除可疑结果） 相对灵敏度：53/58 91.37 % 相对特异性：93/96 97.89 % 相对准确性：146/162 90.12 % 先天性单纯疱疹病毒感染诊断 由于临床表现与其他TORCH病毒感染引起的临床表现相似，所以主要依靠病毒学和血清学检查。如新生儿病毒分离阳性或血中抗HSV IgM 抗体阳性即可确诊。直接荧光抗体法检测病毒抗原亦可迅速诊断。 新生儿单纯疱疹病毒感染诊断 如果母亲产道有疱疹或单纯疱疹病毒阳性者较易诊断。发病后皮肤、粘膜伴有典型疱疹病变者诊断也不太困难。但确诊还是必须依据病毒学和血清学证明。如果病毒分离阳性或/和新生儿血清中出现特异性IgM抗体，或一般抗HSV抗体在病程中有4倍以上的升高均可协助诊断。 | 
