单纯疱疹病毒疫苗的研究进展
来源：中国论文下载中心 [ 09-01-30 14:42:00 ] 编辑：studa20
作者：傅锦坚，林元藻，胡立勇
单纯疱疹病毒是引起生殖器疱疹最常见的原因。近年来生殖器疱疹发病率在许多国家不断上升，成为感染率最高的性传播疾病之一。据WHO 估计每年生殖器疱疹的新发病例约2 000万。而临床上80% HSV感染者表现为无症状感染或症状未被识别,这是造成HSV感染流行的重要因素。尽管现有的抗病毒药物应用能缩短有生殖器疱疹感染的病程，并且对治疗复发性感染取得一些效果，但这些抗病毒药物不能有效预防疱疹病毒原发感染以及控制疱疹病毒潜伏感染和复发性感染。因此，研制和接种HSV疫苗是预防该病毒感染的理想方法。大量研究表明：在动物模型中，已获得HSV疫苗能预防病毒原发感染，并能有效地控制复发性生殖器疱疹感染的证据［1］。目前HSV疫苗的研制日益受到人们的重视［2］，研究较多的有灭活病毒疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、复制受限疫苗、DISC疫苗、活载体疫苗以及DNA疫苗等,现分述如下。
1 灭活病毒疫苗
早期的灭活病毒疫苗是利用加热、化学处理、紫外线照射等方法将接种在鸡胚中的HSV病毒灭活制备疫苗。现在的灭活疫苗是将在细胞中培养的病毒灭活并经过一系列的特别纯化制成的。灭活疫苗既可用于预防HSV感染，也可用于治疗HSV感染。但灭活疫苗存在免疫原性弱、不能诱导机体产生广泛持久的免疫反应、不能确定是否所有病毒均被灭活、裂解的DNA片段潜在致癌的可能性、生产费用高等缺点［3］。因此，目前欧美一些国家已经放弃了对这些疫苗的研制。
2 减毒活疫苗
近年来HSV减毒活疫苗的研制主要集中在造成特异性地缺失病毒基因某一区段，使HSV的神经毒性减弱，建立潜伏感染的能力降低，DNA复制障碍等，同时保持病毒的增殖能力和免疫原性这一目标上。
Post和Roizman等以HSV-1型的F株为原型构建的HSV减毒活疫苗就是通过删减决定疱疹病毒毒性的基因片段来制备的。他们首先将胸苷激酶（TK）基因、以及独特长区域（UL）、独特短区域（US）基因间的连接部分基因切除，目的是去除神经毒性相关基因片段。然后将HSV-2编码糖蛋白gD,gG,gI的基因片段插入内部反向重复序列中，最后，将TK基因重新插入，构建的这种重组病毒称为R7020。在动物和人体内均证实R7020能有效地诱导免疫应答［4,5］。
Prichard［6］以HSV-2的毒株G为原型，将病毒的γ134.5基因、UL55-56基因、UL43.5基因以及US10-12基因去除，将此构建好的重组减毒活疫苗命名为AD472。用HSV野生毒株HSV-2（G）攻击豚鼠生殖道后，给予减毒活疫苗AD472。结果显示，肌肉注射AD472后，可以减少原发性生殖道感染的发生，减轻皮损症状，减少排毒，同时还可以降低病毒复发率，表明该重组减毒活疫苗能减少潜伏感染的建立以及能抑制潜伏病毒的再激活，其抗感染作用较强。
ICP10是HSV 复制所必需的核糖核苷酸还原酶。Wachsman［7］等将其大亚基蛋白激酶(PK) 去除后，评价这种重组复制减毒活疫苗ICP10△PK在减少和预防豚鼠生殖器疱疹复发中的作用。结果解剖鼠的神经节后，发现疫苗接种组仅有12%的个体神经节中有病毒潜伏，远低于对照组（70%），并且疫苗接种组神经节内病毒DNA数量也明显低于对照组。疫苗接种组鼠HSV原发感染率为6%，复发感染率为6%；而安慰剂组鼠HSV原发感染率为100%，复发率为70%。以上结果表明，ICP10△PK重组复制减毒活疫苗能保护机体抵抗HSV感染，明显减少潜伏感染和临床复发，是一种较好的预防性和治疗性疫苗。另据报道，ICP10△PK重组复制减毒活疫苗能激发HSV特异的CD4+Th1反应以及CD8+细胞毒性T淋巴细胞的抗病毒活性，其抗感染能力较强［8］。
但也有报道指减毒活疫苗隐患较多，一方面，重组的HSV病毒经过反复的细胞培养后，仍然不能获得稳定的减毒株，减毒活疫苗可能重新获得病毒毒性；另一方面，减毒的病毒可能会潜伏于病人体内，有可能会与感染的HSV野生病毒株重组，重新获得病毒毒性。此外，某些HSV基因也存在致癌的潜在可能。从HSV减毒活疫苗存在的这些缺陷来看，HSV疫苗的发展趋势在于活载体基因工程疫苗。
3 亚单位疫苗
许多研究采用HSV表面糖蛋白作为免疫原来制作亚单位疫苗。HSV糖蛋白定位于病毒囊膜上,包膜蛋白均为糖基化蛋白,这些糖蛋白产生的免疫应答与病毒的中和作用有关。已发现的HSV糖蛋白有11种,目前亚单位疫苗研究的热点在HSV的gB和gD，因为它们均能诱导体液免疫和细胞免疫［9］。在HSV-1和HSV-2感染者体内，这2种蛋白抗原均较易被抗体识别，激发迟发超敏反应和T细胞增殖反应。gD是抗HSV感染中最重要的保护性抗原，能保护动物免受HSV的攻击，抑制潜伏感染的发生。甚至当病毒已经在机体建立潜伏感染后，还能降低病毒的复发率。
早期人们从HSV感染的细胞培养物中分离纯化病毒的包膜糖蛋白来制取亚单位疫苗。目前，除了从感染的细胞溶菌产物中分离gB、gD之外，人们还可利用DNA 重组技术,在大肠杆菌、酵母、杆状病毒、哺乳动物细胞等多种表达系统中分别或联合表达各种HSV 表面糖蛋白, 制成亚单位疫苗。以上疫苗分别在动物和人体中进行了试验，较有意义的结果主要来自重组亚单位疫苗［10］。动物实验证实，亚单位疫苗能不同程度地诱导机体产生中和性抗体，抗体产生水平高低与动物遭受病毒感染的程度成正比。该疫苗还可不同程度地降低动物被病毒感染后的发病率和死亡率。
一种较有前景的亚单位疫苗是由GSK公司生产的HSV-2gD-明矾-MPL疫苗。在早期的实验中，这种疫苗显示出较强的免疫原性［11］，可诱发保护性免疫应答。当这种疫苗用于HSV复发感染的豚鼠模型时，能刺激鼠产生γ-干扰素、IL-2等细胞因子。
Roberto［12］等评价了一种以氢氧化铝作为佐剂的重组gB-gD-gE亚单位疫苗在治疗豚鼠复发生殖器疱疹中的作用。使用病毒攻击豚鼠建立HSV复发感染模型后，于豚鼠皮下注射疫苗，1周注射7 d，间隔1周再重复接种，连续5周。以后每隔半个月接种1次，共免疫接种23次。结果表明，此亚单位疫苗能有效地降低豚鼠HSV-2复发感染的频率。按照这种接种方法，在人体接种重组gB-gD-gE亚单位疫苗或许能治疗人类复发生殖器疱疹感染。目前，进一步的实验正在进行中。
尽管gB和gD是HSV的主要抗原,能引起机体体液免疫和细胞免疫反应,由于HSV免疫是一个复杂的过程,单凭某种抗原尚不足以建立完全的免疫保护［13］。使用亚单位疫苗,就不可避免面临窄谱、效果短暂等问题。为此人们正在寻找控制HSV复发感染的重要免疫效应因子以及病毒作用的靶点，以期在未来能开发出一种高效的治疗性疫苗。
4 活载体基因工程疫苗
非致病性的活载体基因工程疫苗是把表达HSV-2抗原的基因插入到能完整复制的病毒或细菌载体上。HSV活载体基因工程疫苗兼具了减毒活疫苗和亚单位疫苗的优点，同时它能避免HSV的毒性、潜伏性、活化以及致癌性等问题。目前人们研究的非致病性复制载体包括：牛痘病毒、腺病毒、水痘-带状疱疹病毒、腺相关病毒、沙门氏菌［14,15］等。在免疫接种时，这些病毒或细菌的载体能表达具有免疫原性的蛋白，并且相关基因编码产物能诱导体液免疫以及细胞免疫。
在众多载体中，最令人感兴趣的是腺病毒载体。其独特优势在于腺病毒基因组内有2个能插入外源基因的功能区域，第一个位于基因组的左侧，称为E1区，此区域是腺病毒复制必需区。第二个是E3区，该区是腺病毒复制非必需区。Gallichan［14］等用表达HSVgB的重组腺病毒作为活疫苗在鼠鼻腔内接种后，产生局部黏膜免疫，并能有效抵抗HSV的致死剂量攻击。血清中IgG和IgA抗体水平较高，且从小鼠的阴道洗液中能检出IgA抗体，说明该疫苗局部免疫效果较好。这个突出的特点使得腺病毒载体疫苗有望能成为有效的预防性疫苗之一。Clement［16］等利用同源重组技术，将HSV-2胸苷激酶的基因插入到细菌人工染色体（BAC）序列中，将来自于感染细胞内的重组病毒DNA转染大肠杆菌，当再次转染哺乳动物细胞时，HSV2-BAC DNA具有感染性，而目的病毒胸苷激酶为阴性。将构建好的HSV2-BAC DNA疫苗接种于鼠体内，能诱发较强的HSV-2特异性抗体反应，且该疫苗能保护鼠免遭HSV致死剂量攻击。该实验结果表明，使用BAC载体构建HSV-2疫苗是一种新颖的技术，未来有望将这种技术应用于分析HSV-2的免疫效应，其开发前景较好。
5 复制受限或复制缺损的突变疫苗
这种方法结合了减毒活疫苗以及灭活疫苗的某些优点。制备方法是将病毒复制必需基因部分去除后，缺陷性病毒疫苗在经过遗传改造过的细胞株里生长，以构成性地表达缺失的基因产物［1］。子代病毒缺乏必需基因产物，因而没有传染性。研究表明，在动物实验中，这种疫苗具有抗HSV原发感染作用［17］。Forrester 等研制出一种新颖的HSV疫苗，研究者将gH基因从HSV病毒基因组中剔除出去。由于介导HSV进入细胞的糖蛋白是gH，如果缺失了表面gH的基因后，病毒在宿主细胞中能完成一个完整的复制周期，但其释放出来的子代病毒由于缺乏gH而不具备感染性。这种病毒称之为非感染性单周期（DISC）病毒。该种缺陷突变病毒除了不能表达gH蛋白以外，并不影响其它HSV蛋白质的表达。一项实验显示。使用gH缺失的DISC疫苗后，能预防HSV感染，而初次皮损后使用该种疫苗，其复发率明显降低。目前，第一期的临床试验［18］显示，这种疫苗安全，免疫原性较强。
6 DNA疫苗
DNA疫苗,作为20世纪90年代兴起的一种以核酸为基础的全新免疫接种技术,为疫苗的研制开辟了新的途径。DNA疫苗主要是将病毒的编码基因插入质粒DNA中，直接接种于机体后，能在体内表达相应的病毒蛋白，并诱导机体产生特异性的体液免疫及细胞免疫反应［19,20］。因为蛋白抗原在体内源源不断地产生，故免疫时间长。它具有活载体免疫的某些优点，能克服由非复制性抗原所诱导的细胞免疫效果较低等难题，并且不用担心病毒的减毒作用等问题。因而，即使没有有效的佐剂，这种疫苗也能诱导强的细胞免疫。
目前，研究得最多的HSV DNA疫苗是HSV-2gD疫苗以及gB DNA疫苗。豚鼠生殖器疱疹动物模型实验表明，与对照组相比，这2种疫苗的免疫原性强，不但能预防HSV原发感染、明显减少病毒在阴道内的复制，而且能减少病毒的潜伏感染，并且临床复发率也明显降低［21］。x
随着分子生物学和分子克隆技术的发展，人们研制HSV DNA疫苗的技术越来越多，思路也越来越广。现将近年来HSV DNA疫苗研制的进展分述如下：
多效价DNA疫苗的研制：Hyung［22］等构建了HSV-2gB2、HSV-2gD2以及HSV-2 gB2：gD2三种DNA疫苗，比较了它们的免疫原性和保护作用。结果显示：HSV-2 gB2：gD2DNA疫苗诱发的中和抗体滴度明显高于gB2及gD2组的抗体滴度。并且此二价DNA疫苗对HSV致死剂量攻击的保护作用也比单用gB或gD DNA疫苗效果要好。同时，它所诱导的CTL细胞毒性效应也比其余2种单效价疫苗要强。
重组质粒DNA疫苗的研制：细菌来源的质粒DNA含有大量非甲基化的以CpG为核心的核苷酸序列，这些核苷酸序列能通过多种途径活化细胞因子如：γ-干扰素、IL-l2、IL-18等。Domingo［23］等将编码HSV-2gB、gD两种蛋白的序列嵌合于质粒DNA后，免疫BALB/c鼠，发现小鼠分泌的γ-干扰素的水平增加，并且生存时间比单独用gB或gD编码序列与质粒共构建的DNA疫苗来免疫小鼠的生存时间更长。这些结果提示了使用质粒DNA编码HSV蛋白质嵌合序列以制成DNA疫苗的效果比质粒编码单个蛋白质序列制成的DNA疫苗效果好。利用这种方法，未来我们有望能研制出多价DNA疫苗以抗HSV感染，并为防治其它病原体的感染开辟新的途径。Sara［24］等设计了一种HSV-2 gD DNA疫苗，使用CPG-寡聚脱氧核苷酸即（CPG ODN）作为该疫苗的佐剂以增强其免疫原性，免疫C57Bl/6鼠。结果发现该疫苗诱发了较强的抗HSV感染的免疫反应。并且小鼠体内IgG2c的水平较高，而IgG2c在C57Bl/6鼠体内是一种Th1型免疫反应的指示剂。并观察到多种细胞因子如γ-干扰素、IL-2、IL-4等在体内高水平地表达。
细胞因子为佐剂的DNA疫苗研制：S Lee［25］等选择了包括能编码γ-干扰素的T细胞、NK细胞以及IgG2a同型免疫球蛋白在内的细胞因子基因与质粒DNA共同接种动物。结果表明，该疫苗能提高机体体液免疫以及T细胞的免疫应答，并能降低小鼠HSV感染的发病率。而对细胞因子作为DNA疫苗佐剂的作用效果进行分析时发现，IL-18的作用效果优于IL-12，且系统接种效果优于黏膜接种效果。同时，用该疫苗免疫IFN-γ-/-鼠后，该鼠对于病毒的攻击仍然较为敏感。这表明了疫苗的保护作用主要来自于其诱导产生的γ-干扰素。而γ-干扰素抗HSV感染的作用主要来自于CD4+T细胞和CD8+T 细胞。在HSV抗原和抗原递呈细胞的共同刺激下，这两种细胞均产生大量的γ-干扰素［20,26］。以上结果表明，联合使用能编码细胞因子的DNA，其预期效果较为理想，开发前景较好。
黏附分子LFA-3为佐剂的DNA疫苗研制：T细胞表面的黏附分子如CD2能识别抗原递呈细胞表面的细胞间黏附分子LFA-3。Jeong［27］等将LFA-3的cDNA与gD质粒共接种于小鼠体内，观察该疫苗的免疫调节作用以及抗HSV-2感染的保护作用。结果发现，该疫苗能提高血清中gD特异性的IgG水平。此外，LFA-3还可以使Th细胞的增殖反应提高，并且使脾细胞产生IL-2、γ-干扰素、IL-4、IL-10的数量增多。当用HSV致死剂量攻击小鼠后再使用该疫苗，能明显提高动物的生存率。该研究表明，黏附分子LFA-3能调控HSV感染鼠的抗原特异性免疫应答，这种调控作用是通过诱导CD4+Th1 T细胞亚群增殖反应来实现的。
CCR7配体为佐剂的DNA疫苗研制：CCR7配体SLC和ELC，近年来被认为是在二级淋巴组织中建立功能性细胞微环境以启动免疫反应的关键分子。Eo［28］等把编码gB以及CCR7配体的质粒DNA通过系统给药和黏膜给药两个途径免疫BALB/ c鼠，以观察不同给药途径的免疫效果。系统性地同时给予CCR7 两种配体,可以提高血清中gB特异性的IgG 水平，而阴道以及皮肤黏膜IgA的水平并无明显改变。与此相反的是,通过黏膜免疫可以显著提高黏膜IgA 水平,而不影响血清IgG水平。同时，CCR7配体还能提高T细胞介导的免疫反应。尤其令人感兴趣的是，SLC能使脾产生Th1型细胞因子（如IL-4以及γ-干扰素）的数量增多；而ELC能使脾产生Th-1型和Th2的细胞因子（如IL-4）的数量增多（P均<0.05）。此外，共接种CCR7配体疫苗后，研究者观察到鼠二级淋巴组织中树突状细胞的数量明显增加。这些结果显示出，在核酸疫苗抗细胞感染以及抗癌治疗中，CCR7配体可能是一种有用的佐剂。
由此看出，DNA疫苗抗感染作用较强，抑毒作用明显，具有广阔的开发前景。
综上所述，尽管从20世纪20年代起，人们就已经开始研制HSV疫苗，但由于HSV感染是一个复杂的过程，而且涉及到病毒的免疫逃逸等分子机制，导致体内的病毒不能彻底清除，潜伏在感觉神经节的病毒随时可被激活，从而成为临床上比较棘手的问题。目前所获得的HSV疫苗并不能完全阻止HSV感染，但对控制原发感染和复发感染有一定的作用，在一定程度上能降低疾病传播的危险性。大量实验表明，抗HSV感染需要机体的体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫的参与。相信随着人们对HSV致病机制、病毒免疫逃逸的分子机制等进一步阐明，人们将能研制出有效的针对持续性HSV感染的预防性疫苗和治疗性疫苗，并为其它疱疹病毒疾病的治疗开辟新的途径。
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